伯樂（Bio-Rad）CFX Duet實時熒光定量PCR儀的性能驗證，通常包括以下幾個核心部分。這些驗證旨在確保儀器運行狀態(tài)良好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，符合實驗室質(zhì)量管理要求。驗證可以分為安裝/維修后的IQ/OQ驗證和日常/周期性性能監(jiān)控兩部分。

一、伯樂CFX Duet實時熒光定量PCR儀安裝/運行確認(rèn)

這部分通常由工程師執(zhí)行，并提供報告，但用戶需知曉內(nèi)容。

1、安裝確認(rèn)：檢查儀器部件是否齊全、安裝環(huán)境（電源、空間、溫濕度）是否符合要求、軟件安裝等。

2、運行確認(rèn)：通過運行一系列標(biāo)準(zhǔn)測試來驗證儀器的關(guān)鍵性能指標(biāo)。

（1）光學(xué)檢測：使用熒光染料板（如ROX、FAM等）檢查所有激發(fā)/檢測通道是否正常工作，背景噪音是否在允許范圍內(nèi)。

（2）溫度梯度驗證：

加熱/冷卻速率：驗證儀器升降溫速度是否符合規(guī)格。

溫度準(zhǔn)確性與均一性：使用經(jīng)校準(zhǔn)的外部溫度探測儀（如Fluke溫度探頭）驗證儀器顯示溫度與實際溫度的偏差（準(zhǔn)確性），以及樣品孔之間的溫度差異（均一性）。這是PCR結(jié)果可重復(fù)性的關(guān)鍵。

梯度功能驗證：如果驗證梯度PCR功能，需確認(rèn)梯度設(shè)置溫度與實際溫度的一致性。

（3）硬件功能測試：檢查熱蓋壓力、lid加熱溫度準(zhǔn)確性、軟件與硬件通訊等。

二、伯樂CFX Duet實時熒光定量PCR系統(tǒng)用戶日常/周期性性能驗證

這是實驗室用戶需要定期（如每季度、每半年或根據(jù)實驗室SOP）執(zhí)行的核心驗證。

1、精密度（重復(fù)性）驗證

（1）目的：評估儀器在相同條件下多次運行的變異程度。

（2）方法：

使用已知濃度和序列的DNA/cDNA模板（通常是一個穩(wěn)定表達(dá)的看家基因，如GAPDH），進(jìn)行系列稀釋（如10倍梯度稀釋，覆蓋高、中、低濃度）。

將同一樣品（通常選擇中等濃度）加入到整塊板的多個復(fù)孔中（如至少8-10個復(fù)孔，或覆蓋板的不同區(qū)域）。運行標(biāo)準(zhǔn)的qPCR程序。

（3）可接受標(biāo)準(zhǔn)：

Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV%）：通常要求復(fù)孔間Ct值的CV < 1-2%（高濃度樣品應(yīng)更小，如<0.5%）。

擴增曲線形狀應(yīng)高度一致。

2、準(zhǔn)確度與線性范圍驗證

（1）目的：驗證儀器檢測結(jié)果與真實值的一致性，以及在一個濃度范圍內(nèi)響應(yīng)的線性關(guān)系。

（2）方法：

使用上述制備的系列梯度稀釋模板（如5-6個數(shù)量級），每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。

運行qPCR。

（3）可接受標(biāo)準(zhǔn)：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性：計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）。通常要求 R2 ≥ 0.990（理想情況 ≥ 0.998）。

擴增效率：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計算，公式為 Efficiency (%) = [10^(-1/斜率) - 1] × 100%?？山邮芊秶ǔ?90% - 110%（對應(yīng)斜率 -3.58 到 -3.10）。效率接近100%表明儀器檢測準(zhǔn)確。

3、靈敏度（檢測限）驗證

（1）目的：確認(rèn)儀器能夠穩(wěn)定檢測到的低模板量。

（2）方法：使用極低濃度的模板（接近預(yù)期的檢測下限）進(jìn)行多次重復(fù)檢測（如20次重復(fù)）。

（3）可接受標(biāo)準(zhǔn)：檢測到陽性信號的重復(fù)數(shù)占總數(shù)的比例（檢出率）應(yīng)達(dá)到預(yù)設(shè)要求（如 ≥95%）。同時，低濃度樣品的擴增曲線應(yīng)清晰可辨，Ct值相對穩(wěn)定。

4、通道間干擾驗證（針對多色檢測）

（1）目的：驗證多熒光通道同時檢測時，彼此之間是否存在光譜串?dāng)_。

（2）方法：

準(zhǔn)備僅含單一熒光染料（如FAM、HEX/VIC、ROX/Cy5等）的樣品，分別用所有可能接收的通道進(jìn)行檢測。

例如，將純FAM樣品在FAM通道（主要檢測通道）和HEX通道（可能串?dāng)_通道）下讀取信號。

（3）可接受標(biāo)準(zhǔn)：在非指定通道檢測到的信號（串?dāng)_）應(yīng)低于主通道信號的某個百分比（例如 < 1%），或低于設(shè)定的閾值。

三、簡化版日常監(jiān)控建議

1、制備一批分裝好的驗證用DNA和預(yù)混板，長期凍存。

2、定期（如每月）取出一份，在CFX Duet上運行。

3、只需評估關(guān)鍵參數(shù)：復(fù)孔Ct的CV%、標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2和擴增效率、熔解曲線峰型。

4、與歷史數(shù)據(jù)或基線數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，監(jiān)控儀器性能的長期漂移。

總結(jié)：伯樂CFX Duet qPCR儀的性能驗證是一個系統(tǒng)過程，核心在于精密度、準(zhǔn)確度/線性、靈敏度和特異性。定期執(zhí)行這些驗證是保證您的qPCR實驗結(jié)果科學(xué)、可靠的基礎(chǔ)。建議參考儀器用戶手冊并結(jié)合實驗室自身的質(zhì)量控制程序（SOP） 來制定詳細(xì)的驗證方案和可接受標(biāo)準(zhǔn)。