伯樂（Bio-Rad）的CFX系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，包括經(jīng)典的CFX96/384以及您提到的CFX Duet，是應(yīng)用非常廣泛的qPCR平臺(tái)。它支持主流的全部檢測(cè)化學(xué)方法。對(duì)于在CFX Duet上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，常用的染料主要分為兩大類：非特異性染料（SYBR Green）和特異性探針（如TaqMan等）。

一、伯樂CFX DUET實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀SYBR Green 染料法

1、通用型：

（1）SYBR® Green I： 黃金標(biāo)準(zhǔn)。幾乎所有品牌的SYBR Green qPCR預(yù)混液（Master Mix）都基于此染料。Bio-Rad自家也提供SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix 等明星產(chǎn)品，特點(diǎn)是含有高保真、熱啟動(dòng)的Sso7d融合酶，特異性高，可防止引物二聚體的干擾。

（2）常用品牌： Bio-Rad、Takara、Thermo Fisher、Qiagen、NEB等公司的SYBR預(yù)混液均可兼容。

2、增強(qiáng)型/高特異性型：

（1）一些預(yù)混液中會(huì)添加特殊成分（如熒光染料、抗體或修飾酶）來進(jìn)一步提高特異性和信噪比。

（2）例如： EvaGreen® 也是一種常見的DNA結(jié)合染料，其飽和濃度更高，在某些應(yīng)用中可能比SYBR Green I更穩(wěn)定。CFX Duet同樣兼容。

3、何時(shí)選擇？

基因表達(dá)分析（相對(duì)定量）。

基因型篩選、熔解曲線分析。

當(dāng)需要快速優(yōu)化或檢測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)時(shí)（成本低，只需設(shè)計(jì)引物）。

二、伯樂CFX DUET實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀特異性探針法

1、TaqMan® 水解探針（最主流）：

（1）探針5‘端帶報(bào)告熒光基團(tuán)（如FAM），3’端帶淬滅基團(tuán)（如TAMRA, BHQ）。PCR延伸時(shí)，Taq酶的水解活性將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光。

（2）CFX Duet兼容所有TaqMan探針檢測(cè)。儀器預(yù)設(shè)了常見熒光基團(tuán)（如FAM, HEX/VIC, CY5, ROX等）的檢測(cè)通道。

（3）常用試劑： Bio-Rad的SsoAdvanced™ Universal Probes Supermix， 或TaqMan™ Universal Master Mix II（來自Thermo Fisher）等。

2、分子信標(biāo)：

（1）莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針，在結(jié)合靶序列后構(gòu)象改變，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離而發(fā)光。特異性也非常高。

（2）同樣兼容CFX Duet。

3、FRET雜交探針（如用于基因分型的探針）：

（1）使用兩個(gè)相鄰的探針，一個(gè)帶供體熒光基團(tuán)，一個(gè)帶受體熒光基團(tuán)。當(dāng)兩者靠近時(shí)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。適用于高分辨率熔解曲線分析。

（2）在一些特殊的SNP分型應(yīng)用中使用。

4、何時(shí)選擇？

定量（如病毒載量檢測(cè)）。

多基因同時(shí)檢測(cè)（多重PCR）。

特異性要求高的應(yīng)用（如區(qū)分同源序列）。

SNP分型。

三、 高分辨率熔解曲線染料

這類染料飽和結(jié)合DNA，可用于區(qū)分序列差異（如SNP、突變檢測(cè)），通常不與SYBR Green混用。

LCGreen®, SYTO®9 等。

在CFX Duet上運(yùn)行后，通過其精確的溫控和熒光采集功能進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析。

四、操作建議：

1、確定實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?是看表達(dá)量（相對(duì)定量）還是精確拷貝數(shù)（定量）？是否需要區(qū)分非常相似的序列？

2、根據(jù)目的選擇化學(xué)方法： 大部分表達(dá)分析用SYBR Green即可；病毒檢測(cè)、多重檢測(cè)用TaqMan探針。

3、選擇成熟的商業(yè)預(yù)混液： 對(duì)于新手和常規(guī)實(shí)驗(yàn)，強(qiáng)烈建議購買包含熱啟動(dòng)酶、dNTPs、Mg2?、優(yōu)化緩沖液和染料的2× qPCR Master Mix。這是簡單可靠的方式。

SYBR法： 可選用 Bio-Rad SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix。

探針法： 可選用 Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix。

4、在CFX Duet軟件中正確設(shè)置：

選擇正確的檢測(cè)化學(xué)（“SYBR" 或 “TaqMan"）。

選擇正確的熒光通道（SYBR用FAM通道；TaqMan根據(jù)探針報(bào)告基團(tuán)選擇FAM、HEX、CY5等）。

關(guān)鍵： 選擇與您所用預(yù)混液匹配的被動(dòng)參考染料（通常是ROX）。這一步設(shè)置錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)異常。

總之，伯樂CFX Duet是一款功能全面的儀器，支持市場(chǎng)上幾乎所有主流的qPCR染料和化學(xué)方法。您只需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇，并在軟件中做好對(duì)應(yīng)設(shè)置即可。