使用伯樂T100梯度PCR儀時(shí)，除了遵循常規(guī)PCR操作規(guī)范外，還有一些針對該型號儀器的關(guān)鍵細(xì)節(jié)和注意事項(xiàng)。熟練掌握這些細(xì)節(jié)能顯著提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和成功率。以下是從操作前、操作中到操作后的詳細(xì)注意事項(xiàng)：

一、BioRad伯樂T100PCR儀 開機(jī)前與程序設(shè)置階段

1、儀器預(yù)熱與校準(zhǔn)：

（1）儀器剛開機(jī)，建議預(yù)熱10-15分鐘，讓熱蓋和樣品槽溫度穩(wěn)定，確保溫度的準(zhǔn)確性。

（2）定期進(jìn)行溫度校準(zhǔn)（尤其是當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差時(shí)）。這通常需要使用專用的校準(zhǔn)儀或由專業(yè)技術(shù)人員完成。

2、程序設(shè)置與驗(yàn)證：

（1）理解梯度功能： 明確梯度的設(shè)置范圍。T100的梯度功能是在樣品槽的同一排（通常是縱向） 設(shè)置一個(gè)線性溫度梯度。例如，設(shè)置梯度為60°C到50°C，意味著同一排從左到右（或從右到左）溫度線性遞減。請勿在設(shè)置梯度的一排放置不同引物或模板的樣品，否則結(jié)果無法解讀。

（2）合理設(shè)置梯度范圍： 初次進(jìn)行退火溫度優(yōu)化時(shí)，梯度范圍可以設(shè)寬一些（如10-12°C）。根據(jù)結(jié)果縮小范圍進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化。范圍過寬可能會(huì)超出酶的適宜溫度。

（3）確認(rèn)熱蓋溫度： 根據(jù)使用的管型（如0.2mL單管、八連排管）正確設(shè)置熱蓋溫度。通常使用默認(rèn)的105°C即可，確保管蓋被緊密壓住，防止蒸發(fā)。

（4）程序命名與保存： 為每個(gè)程序設(shè)置一個(gè)清晰易懂的名稱并保存，避免下次使用時(shí)輸錯(cuò)參數(shù)。

二、伯樂T100梯度PCR儀樣品準(zhǔn)備與放置階段

1、樣品管選擇與質(zhì)量：

（1）使用平蓋、薄壁的專用PCR管/板。管壁厚度不均或拱形蓋會(huì)嚴(yán)重影響熱傳導(dǎo)，導(dǎo)致溫度不準(zhǔn)和蒸發(fā)。

（2）確保管蓋緊閉。放置前，可以用指尖輕輕按壓每個(gè)管蓋確認(rèn)。

2、反應(yīng)體系配置：

（1）確保反應(yīng)液在管底，不要掛在管壁或蓋上。短暫離心將所有液體收集到管底。

（2）體系體積不宜過小，對于0.2mL的管，建議不少于10μL，以保證溫度感應(yīng)的準(zhǔn)確性。

3、樣品放置的“黃金法則"：

（1）對稱放置： 無論是否使用梯度，都盡量將樣品對稱放置在樣品槽中。這有助于熱場均勻，減少邊緣效應(yīng)。

（2）梯度實(shí)驗(yàn)的放置： 進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須將同一反應(yīng)體系的多個(gè)重復(fù)樣本，放置在梯度設(shè)置的那一排上。例如，你要優(yōu)化一個(gè)引物的退火溫度，你需要準(zhǔn)備8個(gè)相同的PCR反應(yīng)管，然后全部放在儀器上用于梯度的那一排（通常是縱向的一列），儀器會(huì)自動(dòng)為每個(gè)管分配不同的退火溫度。

（3）非梯度實(shí)驗(yàn)的放置： 即使不做梯度實(shí)驗(yàn)，也建議將樣品放在樣品槽中部區(qū)域，避免最外圈，因?yàn)檫吘壍臏囟炔▌?dòng)可能稍大。

（4）標(biāo)記位置： 在放置樣品時(shí)，在管蓋或排架上用記號筆標(biāo)記位置（如A1， B2），以便后續(xù)準(zhǔn)確記錄哪個(gè)樣品在哪個(gè)位置。

三、伯樂T100梯度PCR儀運(yùn)行階段

1、運(yùn)行前最終檢查：

（1）再次確認(rèn)程序參數(shù)（溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)）是否正確。

（2）確認(rèn)熱蓋已經(jīng)緊密閉合，聽到“咔嗒"聲。

（3）檢查儀器屏幕顯示的狀態(tài)是否為“Ready"或“Idle"。

2、運(yùn)行中：

（1）儀器運(yùn)行時(shí)，請勿頻繁打開熱蓋，這會(huì)嚴(yán)重干擾溫度控制。

（2）注意觀察儀器運(yùn)行是否正常，有無異常報(bào)警聲。T100的屏幕會(huì)顯示當(dāng)前運(yùn)行的步驟和剩余時(shí)間。

四、 運(yùn)行結(jié)束后

1、取回樣品：

（1）程序結(jié)束后，儀器會(huì)自動(dòng)將樣品槽降溫至4°C或12°C（根據(jù)設(shè)置）進(jìn)行保溫。盡快取出樣品，以免冷凝水在管內(nèi)積聚。

（2）取出時(shí)小心燙傷，雖然樣品槽溫度不高，但熱蓋部分可能仍有余溫。

2、數(shù)據(jù)記錄：

這是梯度PCR最關(guān)鍵的一步！ 立即記錄下每個(gè)樣品在樣品槽中的精確位置以及該位置對應(yīng)的實(shí)際梯度溫度。你可以在儀器的運(yùn)行日志或程序結(jié)果中找到這個(gè)溫度列表。沒有這個(gè)對應(yīng)關(guān)系，梯度實(shí)驗(yàn)就失去了意義。

3、儀器維護(hù)：

（1）保持清潔： 定期用70%乙醇濕潤的無塵紙擦拭樣品槽和熱蓋，去除灰塵、油污和溢出的樣品。切勿使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或高濃度酒精，以免腐蝕金屬表面。

（2）防止污染： 如果有樣品泄漏，務(wù)必立即清潔，防止基因組DNA或PCR產(chǎn)物交叉污染后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（3）長期不用： 如果長時(shí)間不使用，請拔掉電源，并用防塵罩蓋好。

總結(jié)：

使用伯樂T100的核心在于 “理解梯度、規(guī)范放置、準(zhǔn)確記錄" 。只要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)想清楚如何利用梯度功能，在操作時(shí)細(xì)心規(guī)范，并養(yǎng)成及時(shí)記錄的好習(xí)慣，就能充分發(fā)揮這臺高性能儀器的優(yōu)勢，為您的實(shí)驗(yàn)帶來極大的便利。