使用伯樂(lè)（Bio-Rad）CFX Opus 96 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，要獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)的結(jié)果，需要注意非常多的細(xì)節(jié)。這些細(xì)節(jié)貫穿于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、程序設(shè)置、運(yùn)行和數(shù)據(jù)分析的整個(gè)過(guò)程。

以下是一份詳細(xì)的注意事項(xiàng)清單，您可以將它作為標(biāo)準(zhǔn)操作程序的補(bǔ)充參考：

一、伯樂(lè)CFX Opus 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與體系配制

這是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)，“垃圾進(jìn)，垃圾出" 的原則在這里體現(xiàn)良好。

1、RNA/DNA 模板質(zhì)量：

純度：確保模板的A260/A280比值在理想范圍內(nèi)（DNA: ~1.8， RNA: ~2.0），A260/A230 > 2.0，表明沒(méi)有蛋白質(zhì)、酚、鹽類(lèi)等污染。

完整性：對(duì)于RNA，務(wù)必通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)其完整性（清晰的28S和18S條帶）。

準(zhǔn)確定量：使用微量分光光度計(jì)（如NanoDrop）精確測(cè)定模板濃度。對(duì)于靈敏度要求高的實(shí)驗(yàn)，推薦使用Qubit等熒光定量法進(jìn)行精確定量。

2、引物和探針：

設(shè)計(jì)與驗(yàn)證：使用可靠的軟件設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)常規(guī)PCR和凝膠電泳驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率（理想效率在90%-110%之間）。

濃度優(yōu)化：進(jìn)行引物濃度梯度優(yōu)化，找到產(chǎn)生低Ct值、高熒光信號(hào)且無(wú)非特異性擴(kuò)增的良好濃度。通常終濃度在100-500 nM之間。

妥善保存：避免反復(fù)凍干，建議配制高濃度母液，分裝后于-20℃保存。

3、試劑與體系配制：

Master Mix選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的預(yù)混液（如SYBR Green或TaqMan探針?lè)ǎ?。確認(rèn)預(yù)混液是否包含ROX等被動(dòng)參考染料（CFX Opus通常不需要，但需根據(jù)預(yù)混液說(shuō)明書(shū)確認(rèn)）。

充分解凍和混勻：將所有試劑（預(yù)混液、引物、模板）解凍并渦旋振蕩混勻，短暫離心收集管壁液滴。

在冰上操作：酶和熒光染料對(duì)溫度敏感，整個(gè)配制過(guò)程應(yīng)在冰上進(jìn)行。

精確移液：使用校準(zhǔn)過(guò)的移液器和高質(zhì)量的帶濾芯吸頭，避免交叉污染和取樣誤差。對(duì)于低濃度模板，建議增加技術(shù)重復(fù)（至少3個(gè)復(fù)孔）。

“無(wú)模板對(duì)照"和“無(wú)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照"：

NTC：必須設(shè)置！用于檢測(cè)體系是否存在引物二聚體或試劑污染。

對(duì)于qRT-PCR：必須設(shè)置No-RT Control（用水代替逆轉(zhuǎn)錄酶），用于檢測(cè)基因組DNA污染。

4、加樣與封板：

避免氣泡：加樣時(shí)吸頭應(yīng)深入液面以下，緩慢打出液體，避免產(chǎn)生氣泡。如有氣泡，可在離心機(jī)中短暫離心去除。

精確封板：使用光學(xué)級(jí)封板膜。貼膜時(shí)，使用專(zhuān)門(mén)的封板器或刮板，確保封板膜平整、無(wú)褶皺、密封，防止運(yùn)行過(guò)程中蒸發(fā)和交叉污染。

二、伯樂(lè)CFX OPUS96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器設(shè)置與程序編輯

1、創(chuàng)建實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

熒光通道選擇：根據(jù)您使用的染料（如FAM for TaqMan, SYBR Green）正確選擇光學(xué)檢測(cè)通道。不要選錯(cuò)，否則檢測(cè)不到信號(hào)。

三步法 vs 兩步法：通常使用三步法（退火、延伸分開(kāi)）有助于提高特異性，而兩步法（退火和延伸合并）可以縮短運(yùn)行時(shí)間。請(qǐng)根據(jù)引物和預(yù)混液的推薦進(jìn)行選擇。

溫度與時(shí)間：嚴(yán)格按照預(yù)混液和引物說(shuō)明書(shū)推薦的條件設(shè)置。常見(jiàn)的錯(cuò)誤是退火溫度設(shè)置不當(dāng)。

熔解曲線：對(duì)于SYBR Green法，熔解曲線分析是必須的！ 程序應(yīng)自動(dòng)添加熔解曲線步驟（通常從65℃緩慢升溫到95℃，每0.5℃采集一次信號(hào)），用于確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性和特異性。

2、板設(shè)置：

正確標(biāo)注樣品類(lèi)型：在軟件中清晰、準(zhǔn)確地定義每個(gè)孔的樣品類(lèi)型（未知樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、NTC、NRT等）。這是后續(xù)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)。

設(shè)置重復(fù)和技術(shù)重復(fù)：如果板上有生物學(xué)重復(fù)或技術(shù)重復(fù)，務(wù)必在軟件中將其歸為一組，以便軟件自動(dòng)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

導(dǎo)入/導(dǎo)出模板：對(duì)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以保存板設(shè)置模板，下次直接調(diào)用，避免手動(dòng)輸入錯(cuò)誤。

三、伯樂(lè)CFX OPUS96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器運(yùn)行與維護(hù)

1、運(yùn)行前檢查：

確認(rèn)樣品板在樣品槽中放置平穩(wěn)，方向正確。

確認(rèn)熱蓋已擰緊，與反應(yīng)板接觸良好，以保證傳熱均勻和防止蒸發(fā)。

2、儀器維護(hù)：

清潔光學(xué)元件：定期（如每季度或根據(jù)使用頻率）使用儀器配套的清潔工具或無(wú)水乙醇和無(wú)塵紙清潔光學(xué)元件表面，確保熒光檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

軟件更新：保持CFX Maestro軟件的更新，以獲取新的功能和錯(cuò)誤修復(fù)。

四、伯樂(lè)CFX OPUS96實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析與解讀

1、基線閾值設(shè)定：

軟件通常會(huì)自動(dòng)設(shè)置，但需要手動(dòng)檢查?；€應(yīng)設(shè)置在擴(kuò)增曲線剛剛開(kāi)始呈指數(shù)增長(zhǎng)的平坦階段。閾值線應(yīng)設(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期的線性范圍內(nèi)。所有樣本的基線設(shè)置必須一致。

2、Ct值確認(rèn)：

檢查所有樣本的擴(kuò)增曲線是否平滑、呈典型的S形。異常的曲線（如起跳過(guò)早、平臺(tái)期信號(hào)低、有多個(gè)峰）表明可能存在問(wèn)題。

確認(rèn)NTC和No-RT Control的Ct值遠(yuǎn)大于目標(biāo)樣本（通常Ct > 35 或 無(wú)Ct值），否則說(shuō)明存在污染。

3、熔解曲線分析（SYBR Green）：

查看熔解曲線是否為單一、尖銳的峰。如果出現(xiàn)雙峰或?qū)挿?，表明存在引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，該樣本的數(shù)據(jù)不可信。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線與效率（定量）：

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋必須精確，并且要覆蓋足夠?qū)挼姆秶ㄍǔＶ辽?個(gè)數(shù)量級(jí)）。

檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值（應(yīng)>0.98）和擴(kuò)增效率（應(yīng)在90%-110%之間）。如果效率不佳，需要重新優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

5、內(nèi)參基因的選擇與相對(duì)定量（ΔΔCt法）：

選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因（如GAPDH, β-actin, 18S rRNA等）至關(guān)重要。在不同實(shí)驗(yàn)條件下，內(nèi)參基因的表達(dá)量也可能發(fā)生變化，需要進(jìn)行驗(yàn)證。

使用ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量時(shí)，確保所有計(jì)算步驟正確。

五、總結(jié)：常見(jiàn)問(wèn)題排查清單

1、無(wú)擴(kuò)增信號(hào)：檢查試劑是否失活、引物是否正確、模板質(zhì)量/濃度、程序設(shè)置（特別是退火溫度）、熒光通道選擇。

2、Ct值過(guò)大：模板降解或濃度過(guò)低、試劑失效、PCR抑制物存在、程序效率低。

3、重復(fù)性差：模板定量不準(zhǔn)、移液誤差、試劑未充分混勻、反應(yīng)板密封不嚴(yán)或有氣泡。

4、NTC有擴(kuò)增：引物二聚體（優(yōu)化引物濃度/退火溫度）、試劑或環(huán)境被模板或擴(kuò)增產(chǎn)物污染（更換試劑，清潔工作臺(tái)）。

5、熔解曲線出現(xiàn)雙峰：引物特異性差、有引物二聚體、退火溫度過(guò)低。需要重新設(shè)計(jì)或優(yōu)化引物。