Bio-Rad伯樂T100梯度PCR儀器的詳細(xì)操作使用指南。無論您是初學(xué)者還是需要復(fù)習(xí)，按照以下步驟都能安全、準(zhǔn)確地完成實(shí)驗(yàn)。

一、伯樂T100梯度PCR系統(tǒng)創(chuàng)建和運(yùn)行程序

T100的界面非常直觀，主要通過旋鈕和按鈕進(jìn)行操作。屏幕會(huì)顯示清晰的菜單。

1、步驟1：創(chuàng)建新程序或選擇已有程序

新程序： 在主菜單，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕選擇 “New Protocol" ，然后按旋鈕確認(rèn)。

已有程序： 選擇 “Saved Protocols"，從列表中找到您之前保存的程序，按“Run"運(yùn)行。

2、步驟2：設(shè)置溫度與時(shí)間（程序核心）

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR程序通常包含以下步驟，您需要逐一設(shè)置：

（1）熱蓋溫度：

儀器會(huì)自動(dòng)提示設(shè)置熱蓋溫度。為了防止液體蒸發(fā)，請(qǐng)將其設(shè)置為 105°C。這是T100的推薦值，務(wù)必確保熱蓋緊密壓住管蓋。

注意： 如果您使用的是帶有熱蓋密封膜的96孔板，也需要將熱蓋溫度設(shè)為105°C。

（2）預(yù)變性：

這是高溫步驟，用于激活熱啟動(dòng)酶并使模板DNA變性。

溫度： 94°C - 98°C （根據(jù)您使用的DNA聚合酶說明書推薦設(shè)置，常用 95°C）。

時(shí)間： 2 - 5分鐘。

（3）變性：

溫度： 94°C - 95°C

時(shí)間： 20 - 30秒

退火：

這是使用梯度功能的關(guān)鍵步驟！

設(shè)置梯度： 在設(shè)置退火溫度時(shí)，屏幕會(huì)提示您是否啟用梯度。選擇“Yes"或“Gradient"。然后您需要設(shè)置一個(gè)溫度范圍。

例如： 您想測(cè)試55°C到65°C之間的良好退火溫度。您可以設(shè)置 Gradient: 55 - 65°C。儀器會(huì)自動(dòng)在樣品槽的不同列生成一個(gè)溫度梯度（例如，從左到右：55°C, 57°C, 59°C, 61°C, 63°C, 65°C）。

（4）最終延伸：

在所有循環(huán)結(jié)束后，進(jìn)行一次充分的延伸，確保所有PCR產(chǎn)物都是全長(zhǎng)的。

溫度： 72°C

時(shí)間： 5 - 10分鐘。

（5）最終保存：

反應(yīng)結(jié)束后，保持樣品在低溫以防止降解。溫度： 4°C 或 10°C

時(shí)間： 無限期（“Forever"），直到您取出樣品。

3、步驟3：設(shè)置循環(huán)數(shù)

在設(shè)置完所有溫度步驟后，系統(tǒng)會(huì)提示您設(shè)置第3步（循環(huán)擴(kuò)增）的循環(huán)次數(shù)，通常設(shè)為30-35個(gè)循環(huán)。

4、步驟4：命名和保存程序

程序設(shè)置完成后，系統(tǒng)會(huì)提示您為程序命名（例如，“Mouse_GeneX_Gradient"）。

建議使用一個(gè)能清晰反映實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的名稱，然后選擇“Save"保存。這樣下次可以直接調(diào)用。

5、步驟5：運(yùn)行程序

（1）放置樣品： 將蓋緊的PCR管或96孔板平穩(wěn)地放入儀器的樣品槽基座上。確保管蓋閉合。

（2）下拉熱蓋： 用力且平穩(wěn)地將儀器上方的熱蓋向下壓到底。您會(huì)感覺到明顯的阻力，這表明熱蓋已經(jīng)壓緊樣品管。

（3）開始運(yùn)行： 在屏幕上確認(rèn)程序信息無誤后，按下 “Start Run" 按鈕。

（4）運(yùn)行監(jiān)控： 儀器開始運(yùn)行，屏幕上會(huì)顯示當(dāng)前運(yùn)行的步驟、剩余時(shí)間、當(dāng)前溫度等信息。您可以隨時(shí)監(jiān)控運(yùn)行狀態(tài)。

二、伯樂T100梯度PCR運(yùn)行后操作

1、運(yùn)行結(jié)束： 當(dāng)程序運(yùn)行完畢，儀器會(huì)發(fā)出蜂鳴聲提示，并顯示“Run Complete"。

2、取出樣品：

先抬起熱蓋！ 小心地向上打開熱蓋。

戴上防燙手套或用鑷子取出PCR管/板，因?yàn)闃悠凡劭赡苓€很熱。

立即將PCR產(chǎn)物置于冰上或轉(zhuǎn)移到4°C冰箱保存，以備后續(xù)的電泳或分析。

3、關(guān)閉儀器： 如果接下來沒有其他用戶使用，可以關(guān)閉電源。

三、重要注意事項(xiàng)與技巧

1、梯度PCR設(shè)計(jì)： 利用梯度功能可以快速優(yōu)化退火溫度。建議在預(yù)估良好退火溫度上下各設(shè)置5°C的范圍。

2、熱蓋是關(guān)鍵： 熱蓋未壓緊或溫度設(shè)置錯(cuò)誤是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的常見原因。務(wù)必確保熱蓋壓緊且溫度為105°C。

3、防止污染： 始終使用無菌的槍頭和試管，在干凈的區(qū)域配制反應(yīng)體系，以防止DNA污染導(dǎo)致假陽性。

4、程序驗(yàn)證： 運(yùn)行新程序時(shí)，可以不放樣品，空跑一個(gè)程序，觀察溫度變化是否正常，這被稱為“干運(yùn)行"。

5、日常維護(hù)： 保持樣品槽的清潔。如果有液體灑出，請(qǐng)立即用70%乙醇擦拭干凈。